外泌體在1980年首次被發現，被認為是活細胞的排泄廢物。其徑粒約為30-150 nm，廣泛散布于各類體液及植物中，受脂質雙分子膜的保護，內容物穩定，在豐度和穩定性上有明顯的優勢，其組成成分主要為蛋白質、核酸、脂質等。它們在分泌細胞和受體細胞之間穿梭介導了細胞間的生物分子傳遞，是不同組織細胞間信息溝通的重要媒介。

技術特點及優勢

1.多種提取方案滿足不同需求：超速離心法金標準；TiO2 適合微量樣本；

2.全系列表征：NTA，電鏡，WB，納米流式一站式解決；

3.多組學聯合分析：全轉錄組學、蛋白質組學、代謝組學全覆蓋、差異篩選；

4.驗證無憂：1mL血清外泌體蛋白組學，從差異蛋白篩選到靶向驗證。

應用領域

• 細胞外囊泡在體內可促進腫瘤發生，控制轉移灶形成和腫瘤免疫反應

• 在心血管疾病方面，可作為心血管系統傳遞的載體，對心臟重塑、血管形成具有病理作用

• 尿液中的外泌體可作為腎臟疾病的潛在生物標志物，反應從足細胞到腎小管的病理變化

• 在肝臟疾病和神經退行性疾病中也會作為相關疾病蛋白的載體，成為早期診斷的潛在生物標志物

研究意義

1，細胞外囊泡可攜帶生物學信息并作用于受體細胞，有助于內環境的穩定，成為某些疾病進展的關鍵調節因子；

2，可作為臨床疾病診斷的一種可靠生物標志物，在疾病診斷、預后判斷、疾病治療中方便為患者提供更多的治療方案；

外泌體的分離純化

外泌體的分離和純化是外泌體蛋白質組學研究的前提。外泌體的提取方法包括TiO2富集法、超速離心法和試劑盒法等，每種方法各有其優缺點，方法的不同對所提純的外泌體大小，形態，密集程度等有所影響。

TiO2富集法：外泌體在TiO2表面化學吸附的驅動力是磷脂雙分子層上的磷酸基團和TiO2之間的配位鍵。由于磷脂雙分子層的柔韌性，可以彎曲以促進與TiO2表面的多位點相互作用，因此可以實現特定而牢固的結合。由于其簡單性和高度的親和力，這種基于共價結合的選擇性富集方法，具有富集效率高，非特異性吸附少，樣品處理時間短等方面的優勢。

超速離心法：超速離心分離外泌體是目前使用廣泛的一種方法，也是目前公認的金標準。其原理是根據外泌體與細胞不同組分的沉降系數不同，利用不同強度離心力使樣品中死亡細胞、細胞碎片、細胞器等組分被分離出去，然后獲得外泌體及部分受到污染的蛋白，用PBS再次重懸清洗離心后即可獲得實驗所需外泌體。超速離心的優點是能夠大量處理樣本，且與其他方法相比提取的外泌體形態及后續的外泌體鑒定與經典文獻描述相似，因此是目前公認的提取外泌體有效可靠的方法。

細胞樣本：細胞樣本的培養基使用量取決于細胞系以及培養狀況，細胞系不同外泌體的釋放量有很大差別，外泌體釋放量高的細胞系幾毫升培養液就足夠；釋放量低的則需要上百毫升。一般來說一個普通的細胞系，用超離分離外泌體，預實驗（摸索條件）起始培液量50ml以上（直接正式實驗建議100-500ml）。細胞培養過程中可以使用無外泌體血清培養基培養，也可以使用含有外泌體的血清培養細胞到一定密度（70-80%），然后吸去培養液，PBS洗數次之后換無血清培液進行培養（建議無血清培養48h后收集細胞上清）。

血液樣本：目前認為血清中外泌體的含量還是比較高的，用促凝管或者抗凝管收集全血3000rpm 4℃ 離心10min，取上清，液氮速凍，保存于-80℃，一般需要3-5ml的血漿/血清樣本。

試劑盒法：近年出現了各種用于分離純化外泌體的商品化試劑盒，目前常用的是由SystemBiOsciences（SBI）研發的EXOQuick試劑盒，該系列的試劑是基于多聚體形式的Exosome提取試劑，形成類似于網狀結果，將一定直徑的微泡捕獲出來，快速有效的提取各種體液樣本中Exosome。

外泌體的表征 

2015國際細胞外囊泡協會指南中給定了這三個實驗聯合鑒定外泌體的方法。三個實驗是相互佐證的 使用電鏡來觀察你的樣品中是否有與外泌體相似的經典結構，有經典結構說明你的樣品中有外泌體或者與外泌體類似的如溶酶體、蛋白聚團、支原體等結構；納米顆粒追蹤分析技術( nanoparticle tracking analysis，NTA)檢測外泌體大小以及數量；WB檢測發現樣品中具有外泌體的標志物，那就一定程度上排除了溶酶體、蛋白聚團、支原體等情況。

外泌體蛋白質組學案例解析

一種基于磷脂雙層與TiO2特異性相互作用的血清外泌體分離新策略

A novel strategy for facile serum exosome isolation based on specific interactions between phospholipid bilayers and TiO2

研究對象：胰腺癌患者和健康供體          期刊：Chemical Science

影響因子：9.346                                   發表單位：北京蛋白質組研究中心

背景介紹

外泌體是細胞衍生的，具有磷脂雙層封閉結構的囊泡。其在細胞間相互作用中起重要作用并調節許多生物過程。越來越多的證據表明，血清外泌體是癌癥早期診斷的潛在生物標志物。為了有助于腫瘤分泌的外泌體的下游分子分析，對純化的外泌體具有較高要求。然而，目前用于外泌體分離的技術耗時且高度依賴于儀器，并且僅具有有限的特異性和回收率。因此，基礎研究和臨床應用都需要快速有效的外泌體分離方法

研究策略

結果速遞

研究人員對TiO2吸附參數進行了研究。當TiO2微球的量從0.5mg增加到10 mg時，分離效率相應提高，在2 mg TiO2處達到95.0％的最大效率， 而TiO 2量進一步增加則導致分離效率降低。因此， 使用2 mg TiO2進行最佳孵育時間評估。 隨著孵育時間從 30 s延長到 5 min，分離效率從53.1％增加到93.4％。當孵育時間延長至10 min時， 分離效率會略微提高至95.5％?；趯r間要求和分離效率的綜合考慮，選擇5 min作為最佳孵育時間。

圖1. 外泌體分離條件的優化

為了證明基于TiO2的外泌體分離策略的可行性，研究人員將其進一步應用于人血清樣品，并通過蛋白質組分析將其與傳統方法（超速離心和共沉淀試劑盒）進行了比較分析。用TiO2從3個生物重復的100 μL血清樣品中分離的外泌體中共鑒定到384個蛋白， 明顯高于超速離心法（228個蛋白）和商業共沉淀試劑盒法（252個蛋白）所測得的結果?？偠灾?，與目前可用的人類血清外泌體分析方法相比，基于TiO2的策略顯示出更好的外泌體分離效率并可減少非特異性蛋白質的吸附。

圖2. 三種方法比較的韋恩圖

使用基于TiO2的策略，從9位健康供體和9位胰腺癌患者的血清樣本中分離出外泌體。從健康組和胰腺癌組中共鑒定到433和581個血清外泌體蛋白。與健康組相比，胰腺癌組中鑒定出59種上調蛋白和6種下調蛋白。使用65種差異蛋白的表達數據，通過無監督的層次聚類分析將來自兩組的樣品重新分組。如預期的那樣，胰腺癌組和健康組可以很好地分開，這表明使用外泌體蛋白譜進行胰腺癌患者生物標志物篩選的潛力。

圖3. 聚類熱圖

該研究通過利用TiO2與外泌體脂質雙層上的磷酸基團的特異性相互作用，從人血清中簡單快速地分離外泌體。這一策略利用了高度親和力的結合，模型外泌體可以可逆地分離。下游表征和蛋白質組分析表明， 該分離方法具有高回收率（93.4％），耗時短（5分鐘內）的特性。最后通過比較胰腺癌患者和健康供者的血清外泌體，蛋白質組學分析表明，許多差異表達的蛋白質與癌癥的發生和發展密切相關，這表明該策略有可能用于大規?；谕饷隗w的生物標志物篩選，并用于癌癥診斷。

參考文獻

Gao F, Jiao F, Xia C, et al. A novel strategy for facile serum exosome isolation based on specific interactions between phospholipid bilayers and TiO2[J]. Chem Sci, 2019, 10:1579-1588.