DIA技術（data-independent acquisition，數據非依賴采集）融合了傳統蛋白質組shotgun的較高通量和質譜定量金標準PRM的定量較準的優點，被Nature Methods雜志評為2015年值得關注的技術。

技術原理

傳統的蛋白質組技術shotgun、Label free、iTRAQ/TMT等在數據采集過程中存在較高的數據丟失和采集的隨機性即DDA（data-dependent acquisition）的采集方式。在這個采集過程中，每個掃描周期內， 質譜只對豐度較高的信號進行二級信號采集，其余信號的二級信號則丟失了。

而DIA（data-independent acquisition）技術原理是將所有的信號預先劃分為幾塊，然后對每塊區域里面的所有一級信號，全部一次性進行二級采集。從而實現了多方面的覆蓋性，以及在此基礎上的重現性。

DIA模式下的信號采集窗口展示

DIA技術優勢

1. 穩定性較好：與傳統的DDA采集模式相比，是無偏好的全息掃描，獲得的信息豐富，解析出的蛋白較普通LFQ方法多，穩定性比較好，缺失值相對較少。

2.定量準確度較高：定量準確度與PRM技術相當。

3.適用范圍廣：單個樣本上機，能進行一定程度上的有或無鑒定，能用于不同組織類型蛋白表達譜的比較。

4.時間跨度大：樣本中加入了保留時間校正的標準肽段，不受上樣時間限制，能夠對不同時間上機的樣本進行保留時間校正后，進行整體數據分析，更適合大樣本量，疾病類樣本。

實驗流程

DIA定量蛋白組學案例解析

血清蛋白質組學鑒定銀屑病及其中藥療效的生物標志物

In-depth serum proteomics reveals biomarkers of psoriasis severity and response to traditional  Chinese medicine

研究對象：血清          期刊：Theranostics

影響因子：8.712         

研究背景

血清和血漿含有豐富的生物學信息，可以反映人體的生理和病理狀況，因此是疾病生物標記物的寶貴樣本類型。但是，由于血清中蛋白質的濃度范圍很廣，因此對血清蛋白質組進行全面的分析具有挑戰性.為解決這一挑戰，作者通過將DIA-MS與可定制的抗體微陣列相結合，開發了一個深入的血清蛋白質組學技術平臺，全面測定銀屑病患者的血清蛋白質組將有助于更好地了解銀屑病的發病機理，并確定診斷和治療的生物標志物.

樣本策略：銀屑病患者血清和健康対照血清

技術策略：抗體微陣列，DIA

驗證策略：ELISA

結果速遞

1、通過文獻挖掘，共找到129種與銀屑病相關的血液蛋白?；谶@些蛋白的抗體制作抗體微陣列，對16例健康人血清、23例銀屑病患者血清、11例經12周銀屑靈治療的銀屑病患者血清進行蛋白質檢測， 發現抗體微陣列檢測血清蛋白的重現性較高。對比銀屑病患者血清和健康人血清， 發現除了已知的銀屑病標志物外，還鑒定到新的在銀屑病患者血清中發生豐度變化的蛋白。

銀屑病特異的抗體微陣列

2、通過QE-HF質譜儀對各組血液樣本進行DIA檢測，共鑒定到283個特異性肽段。對DIA技術進行重復性評價，結果表明樣本間的Pearson相關系數均值為0.85，平均變異系數為4.17%。對銀屑病患者組和健康對照組進行比較發現58種差異蛋白，其中有已知的炎癥和凝血相關蛋白。

DIA檢測銀屑病患者血清蛋白

3、經過生物信息學統計分析與臨床指標的相關性分析結果表明58個差異蛋白（P <0.01）可顯著區分銀屑病患者和健康對照，基于這些差異蛋白進行主成分分析，也同樣可區分兩組，其中一個蛋白PFN1在DIA和抗體兩種技術的定量結果中，均在銀屑病患者和健康對照組中有顯著差異。在發現集和獨立驗證集中，用

ELISA技術對PI3進行驗證，結果均表明其在銀屑病患者組中較高表達。說明其找到的差異蛋白可能成為銀屑病的潛在標志物。進而選取了11例銀屑病患者，經12周的銀屑靈治療，結果有6例患者治療有效，5例患者治療無效。對藥物治療前的治療有效組（n = 6）和治療無效組（n = 5）患者血清蛋白進行比較分析，發現了12種差異表達的蛋白（p<0.05）。對這些蛋白在治療后的表達值進行檢測，發現有效組中FCN2，MIF和MMP1的血清豐度一致高于無效組，表明其可作為預測銀屑靈治療效果的潛在生物標志物。

血液中包含了豐富的生理、病理信息，是疾病生物標志物研究領域的重要材料。然而血液蛋白濃度動態范圍較廣、高豐度蛋白含量較高，導致血液蛋白質組鑒定難度大。本文通過DIA技術和抗體微陣列技術，以銀屑病為疾病模型，對銀屑病治療前、銀屑病中藥（銀屑靈）治療后、健康對照共50例血清樣本建立蛋白質表達譜。鑒定到了106種參與血液凝固、炎癥、細胞凋亡和血管生成等銀屑病相關生物過程的差異蛋白。聚類和主成分分析發現58種蛋白可區分健康組和銀屑病患者，12種蛋白可預測中藥治療效果，相關性分析發現三個血清蛋白（ PI3，CCL22，IL-12B）與銀屑病面積和嚴重程度指數（ psoriasis area and severity index,PASI）評分呈正相關。質譜DIA技術適合大規模臨床樣本的檢測，抗體微陣列技術可補充質譜無法鑒定到的血清低豐度蛋白，本文結合DIA技術和抗體微陣列技術互相彌補對方缺點，使鑒定多的蛋白數量多化。

參考文獻

Xu M, Deng J, Xu K, et al. In-depth serum proteomics reveals biomarkers of psoriasis severity and response to traditional Chinese medicine[J]. Theranostics, 2019, 9 (9): 2475-

結直腸癌(CRC)是全球第四大致命性癌癥，每年有近90萬人死亡。衰老、不良的飲食和生活方式都會增加結直腸癌的風險。盡管治療手段不斷進步，但是對于CRC，特別是轉移性CRC的死亡率在癌癥中仍然很高。2020年11月9日，中國科學院上海生化細胞所吳家睿，曾嶸團隊及海軍醫科大學張衛團隊合作在Cancer Cell上在線發表了題為“Integrated Omics of Metastatic Colorectal Cancer”的研究論文，該研究通過基因組、蛋白組、磷酸化蛋白組學多角度系統的分析了轉移性結直腸癌的分子特征，為CRC的預后評估和個性化治療提供理論依據。

樣本策略

76例早期-非轉移性CRC和70例轉移性CRC患者的480個臨床組織：原發灶和轉移灶（T）、近端癌旁（P）和遠端正常組織（N）、遠處肝轉移組織（LM）外周血細胞（BC）；

技術策略

全外顯子測序、DIA蛋白組學、DIA磷酸化蛋白組學

技術路線

天津蛋白質組學

實驗結果

多組學研究概述

該研究采用多組學方法對146例中國結直腸癌患者（CCRC）的不同組織部位進行分析。作者對330個樣本進行了全外顯子組測序（WES），并采用DIA技術得到了來自480個樣本的蛋白質組和磷酸化蛋白組數據，共檢測到8450個蛋白和47786個磷酸化位點的定量結果。

中國CRC患者的突變特征

對146例患者組織樣本的基因組學檢測結果表明，常見的癌癥相關突變基因為APC(百分之65的突變頻率)、TP53(百分之64)和KRAS(百分之32)。接下來研究人員將我國CRC隊列（CCRC）與TCGA和MSK的CRC數據集進行比較，研究發現三個隊列臨床病理特征存在明顯差異，其中CCRC中CRC的發病率及轉移性CRC（mCRC）的比例很高.

圖1. CCRC的基因組突變圖譜

基于蛋白質組學數據的亞型分類

作者對原發性腫瘤和對照組之間的2440個差異表達蛋白通過共識聚類共分成3種亞型（CC1、CC2和CC3）（圖2A）。CC1集中在RNA加工和DNA錯配修復（MMR）；CC2集中在細胞外基質-受體整合、粘著斑和免疫相關途徑；CC3集中在DNA復制和代謝途徑激活。三種亞型具有不同的沒有復發生存率，與CC1和CC2亞型中的mCRC患者相比，CC3中的mCRC患者的沒有復發存活的概率很低（P = 0.004；圖2C）。相比之下，非mCRC患者在三個亞型中沒有顯著的復發存活差異。

圖2. CCRC的蛋白質組學亞型和每個亞型的臨床意義

磷酸化蛋白質組圖譜鑒別mCRC與非mCRC

基于磷酸化蛋白組數據，在原發性腫瘤和對照組中共鑒定到1487個差異磷酸化位點。對其進行共識聚類，將其分成6個磷酸化蛋白質亞型(圖3A、3B)。其中SC1、SC3和SC5富含mCRC患者，而SC2、SC4和SC6富含非mCRC患者。功能富集分析發現在SC1、SC3和SC5中高表達的磷酸化蛋白在粘附相關通路中顯著富集(圖3C)。而SC2、SC4和SC6中上調的磷酸化蛋白在ERBB2信號轉導、子宮內膜癌、抗原加工和提呈以及FcγR介導的吞噬途徑中顯著富集(圖3C)?；赑hosphoSitePlus數據庫的激酶-底物關系，研究發現在SC1、SC3和SC5中，激酶和磷酸化位點之間大多呈負相關，而在SC2和SC4中，正相關較多(圖3D)。

圖3. CCRC中的磷酸蛋白質組圖譜

磷酸化蛋白質組學為mCRC提供可用藥靶點

對于具有可量化蛋白水平和臨床可操作藥物的激酶，作者分析了42對mCRC的N-T或N-LM組織中相應的磷酸底物豐度(圖4B和4C)，共發現了251對激酶-磷酸底物。我們觀察到mCRC患者不同組織和蛋白質亞型中磷酸底物和激酶的高度異質性(圖4B)。接下來，根據每兩對激酶-磷酸底物之間的皮爾遜相關系數，構建了每種蛋白質亞型中原發和轉移腫瘤的激酶-底物網絡(圖4C)。

圖4. 磷酸底物與相關激酶的富集

為了進一步探索mCRC患者的藥物反應潛力，研究人員在31個miniPDX模型上進行了三種激酶克制劑(阿法替尼、吉非替尼和雷戈拉非尼)的藥理學測試，其中包括9對原發轉移腫瘤和13例其他原發腫瘤。通過腫瘤細胞生長克制(TCGI，百分比)來測量每種腫瘤對每種藥物的藥物反應效果，發現來自同一個體的原發性和轉移性腫瘤對相同藥物可能表現出不同的反應(圖7B)。此外研究人員還根據1696個邊緣強度特征構建了彈性網絡回歸模型，用于預測藥物反應。這些結果表明，激酶-磷酸底物網絡在預測mCRC患者的藥物敏感性方面具有很強的潛力。

圖5. 激酶-底物網絡分析和miniPDX藥物測試

總結

該研究專注于mCRC的多組學數據并提供了原發性和轉移性腫瘤的全球特征圖譜?；趯D移性腫瘤和原發性腫瘤在蛋白質組和磷酸化蛋白質組圖譜上的差異的觀察，作者發現網絡分析結合蛋白質組學和磷酸化蛋白質組學數據可以準確地反映藥物反應。這些結果強烈表明，在選擇IV期患者的治療方案時，應考慮原發灶和轉移灶組織中的蛋白質組/磷酸化蛋白質組圖譜，以便采取有效的個體化治療策略。