蛋白質非標記定量技術（Label-free）是通過液質聯用技術對蛋白質酶解肽段進行質譜分析，無需使用昂貴的穩定同位素標簽做內部標準，只需分析大規模鑒定蛋白質時所產生的質譜數據，比較不同樣品中相應肽段的信號強度，從而對肽段對應的蛋白質進行相對定量。Label-free的技術優勢就在于蛋白質不需要進行標記，所需樣品總量少，耗費低。

技術原理

非標記定量蛋白質組學近年來成為重要的質譜定量方法，按照其原理分，主要有兩種。其中spectrum counts類的非標記定量方法，發展比較早，也形成了多種算法進行定量，但是主要的原理都是根據MS2的鑒定結果作為定量的基礎，各種方法的差別在于后期算 法在大規模數據上的修正。第二種非標記定量方法的原理是以MS1為基礎，計算每個肽段信號在LC-MS質譜上的積分（峰面積）。

Label free流程圖

技術優勢

1.無需昂貴的同位素標簽標記，實驗耗費少，操作簡單；

2.對樣本的操作少，并且不受樣本數目限制

3.可以檢測到的肽段動態范圍可以達到4個數量級以上，提高低豐度蛋白的檢出率和非標定量的準確性；

4.可以檢測不同組樣本中有無差異的蛋白變化；

5.樣本需求量少

應用范圍

基礎醫學、臨床診斷：生物標志物，疾病機理機制，疾病分型，個性化治療等； 

生物醫藥：藥物作用機理，藥效評價，藥物開發等；

微生物領域：致病機理，耐藥機制，病原體-宿主相互作用研究等； 

海洋水產：漁業資源，海水養殖，漁業環境與水產品安全等；

食品營養：食品儲藏及加工條件優化，食品組分及品質鑒定，功能性食品開發，食品安全監檢測等。

Label-free參考案例

寄生植物菟絲子與寄主間大規模的蛋白質交流

Extensive inter-plant protein transfer between Cuscuta parasites and their host plants

研究對象：菟絲子與宿主植物    期刊：Molecular Plant

影響因子：12.084    發表單位：中國科學院昆明植物研究所

研究背景

自然界中約有4000-5000種寄生植物，約占所有被子植物的1%。旋花科菟絲子屬的菟絲子植物是典型的全寄生植物，約有200多種，它的根和葉片退化，有些完全沒有光合能力，有的仍然保留了極其微弱的光合作用，必須依靠寄主才能存活。菟絲子可將自己的莖纏繞在寄主的莖上，并產生吸器侵入到寄主的莖內， 并將自己的木質部與寄主的木質部相連，韌皮部與寄主的韌皮部相連，從而與寄主建立維管束的聯系。目前的研究表明菟絲子能通過這種維管束通道從寄主獲得水分和營養等生長所需物質，同時一些大分子物質，例如病毒，植原體，RNA以及次生代謝產物也能通過這種維管束的連接，在寄主與菟絲子間進行交流，但是目前對于菟絲子與寄主間能否進行大規模蛋白轉運，至今仍然不十分清楚。

青蓮百奧完成了不同植物組織的蛋白質組測序工作。

樣本策略：擬南芥-菟絲子徑段、大豆菟絲子徑段、菟絲子徑段

技術策略：LFQ、轉錄組

驗證策略：western blot、蛋白活性檢測、熒光定量PCR

結果速遞

1.分別鑒定到有 619和 615擬南芥蛋白和 1535和1547大豆蛋白在菟絲子絲近端和遠端莖節中，這占擬南芥  和  大  豆  蛋  白  總  量  的  2 7 . 0 ％ （ 7 3 4 / 2 7 1 4 ） 和37.9％（1807/4765），此外， 在擬南芥和大豆莖中檢測到1027和1674個菟絲子蛋白， 分別是菟絲子總數的17.4（1027/5914） 和 28.3％（1674/5914）， 盡 管 宿主植物產生的蛋白質大部分分布在整個菟絲子中， 通過對比研究發現， 在近端部位特異性檢測到的蛋白質可能具有較高的周轉率， 從而使其在遠端節段中未被檢測到。相反， 一些快速運輸的宿主蛋白可能在菟絲子遠端積累并在近端未檢測到。

2.種子取樣進行蛋白質組分析，在菟絲子和大豆種子中， 我們共鑒定出4186和4797種蛋白質， 分別是978種大豆蛋白和608種菟絲子蛋白被發現分別被運送到菟絲子和大豆的種子中。而且種子中單個外來蛋白質的豐度僅略低于天然蛋白質，運抵大豆種子的蛋白質GO分析表明主要是與初級代謝有關，包括糖酵解過程，三羧酸循環和糖異生以及氧化還原過程和對熱的響應也豐富。

3.寄主和菟絲子的蛋白質組測序結果顯示，幾百種到超過1500種的蛋白質能在寄主和菟絲子間進行交流，而且上百個轉運蛋白還能被傳輸和積累到菟絲子與寄主的種子中。自然界中，菟絲子經?？梢詫⒉煌募闹魍瑫r連接起來，不同寄主間超過七百個蛋白質能通過菟絲子“通道”進行長距離運輸。通過利用質譜信號估算，至少11.5%的蛋白質在到達受體植物后還能保持至少50%的蛋白量。此研究還利用多個報告蛋白證明，很可能多數轉運蛋白質在經過長距離運輸到達受體植物后仍保有其生物學功能，且可能對受體植物的生長發育及抗逆性產生影響。

該研究首次揭示了寄主-寄生植物間以及通過菟絲子連接的不同寄主間能進行大規模的蛋白質交流.由于菟絲子能夠寄生不同科屬的植物，因此科和屬特異的蛋白也能夠跨不同科屬直接轉運至受體植物，從而可能使受體植物獲得嶄新的性狀。該研究對了解植物間相互作用的分子機制有較重要意義，也為植物體內物質

（包括信號）的長距離運輸的研究提供了新視角和新的研究方法.

參考文獻

Liu N, Shen G, Xu Y, et al. Extensive Inter-plant Protein Transfer between Cuscuta Parasites and Their Host Plants[J]. Mol Plant, 2019.