熱蛋白質組學(TPP)是基于蛋白質在受熱時變性溶解度降低的原理。蛋白質可以在與小分子(如藥物或代謝物)、核酸或其他蛋白質相互作用時或在翻譯后修飾時改變其熱穩定性。TPP使用基于多重定量質譜的蛋白質組學來監測數千種表達蛋白質的熔解曲線。重要的是，這種方法可以在體外或在體內進行。它已被成功地應用于識別藥物的靶標和非靶標，或研究蛋白質-代謝物和蛋白質-蛋白質相互作用。因此，TPP為蛋白質在原生環境和蛋白質組范圍內的蛋白質狀態和相互作用提供了獨特的見解，使我們能夠研究基本的生物學過程及其潛在的機制。接下來介紹一篇TPP的應用案例。

寄生蟲(線蟲)會導致破壞性疾病，給世界各地的人類和其他動物帶來巨大的痛苦。這些寄生蟲的控制在很大程度上依賴驅蟲療法，但治療失敗和對這些藥物的耐藥性普遍存在。由于開發針對寄生線蟲的疫苗在很大程度上沒有成功，人們越來越重視發現新的驅蟲方法來對抗抗藥性蠕蟲。2022年10月14日，Frontiers in Pharmacology雜志(IF:5.988)上在線發表了題為“Thermal proteome profiling reveals Haemonchus orphan protein HCO_011565 as a target of the nematocidal small molecule UMW-868”的研究論文。該研究采用熱蛋白質組學(TPP)來探索HIT藥理學。利用的結構預測和對接工具，推斷出驅蟲小分子（HIT化合物：UMW-868）在高致病性捻轉血矛線蟲（Haemonchus contortus）和其他具有重要社會經濟意義的寄生線蟲中的全新寄生蟲特異性靶標(HCO_011565)。

作者測量了經UMW-868處理的捻轉血矛線蟲xL3s的細胞死亡。暴露90小時后，在UMW-868-處理的xL3s（>5μM）中檢測到細胞死亡，而用非活性類似物（A-3155）處理的xL3s仍然存活（圖1A）。在50μM時，UMW-868可100%殺死處理過的xL3s，其IC50值為34.8uM(圖1B)。暴露于UMW-868 168h后，幼蟲全身可見死亡細胞(圖1C)，而暴露于A-3155或DMSO的xL3s則未檢測到死亡細胞(圖1C)。接下來測試了UMW-868對HepG2細胞和線粒體的毒性；UMW-868在高達100μM的濃度下沒有表現出任何明顯的細胞毒性或有絲分裂毒性(圖1D)。

前期實驗證明了UMW-868具有驅蟲活性，并且對哺乳動物肝細胞沒有細胞或線粒體毒性，接下來的目標是確定該化合物的作用靶點。利用熱蛋白質組學(TPP)，共鑒定和定量了3,678個蛋白。通過非參數響應曲線分析(NPARC)評估定量蛋白質的熱熔曲線，將非參數模型與溫度曲線數據擬合后，得到了2,591條不同的熔解曲線圖譜。經過篩選共鑒定了55種蛋白質，它們的熱穩定性和豐度在UMW-868存在的情況下發生了變化。在這55種蛋白質中，兩種未表征的蛋白質(分別由基因HCO_011565和HCO_014287編碼),在UMW-868存在下表現出高的熱穩定性(圖2)，這表明它們是UMW-868的作用靶標。

圖2. 兩個潛在蛋白質靶標的熔解曲線

隨后，作者研究了這兩個分子的轉錄表達水平。研究發現HCO_011565在H. contortus的所有關鍵發育階段都有轉錄表達，在卵、L3、L4(四齡幼蟲)和成蟲階段都有高表達。對于HCO_014287，僅在L2和L3階段記錄到中到高的轉錄水平，但在其他發育階段表達有限或沒有表達(圖3B)?；谶@些發現，選擇了HCO_011565作為進一步的研究對象。

藥物化學導致H. contortus的效力增強

接下來作者探究了改變其（UMW-868）化學結構以嘗試增強效力。在UMW-868的“南部區域”，用噻吩取代芳基環不會改變xL3s運動效力（A-3126；IC50 12.1 μM）。然而，效力隨著向芳基中添加4-甲基（A3136；IC50 4.8 μM）而增加，并隨著4-三氟甲基取代（A-6501；IC50 1.6 μM）而進一步增強。在“北部區域”（R2），用乙氧基取代正丙基提高了效力（A-3134；IC50 7.8 μM），并通過引入4-二氟甲氧基進一步增強了效力（A- 4340；IC50 4.0 μM）。根據xL3s活力降低的結果，其中一些修飾類似物（即 A-3136、A-6318、A-6501和 A-4340）增強了對幼蟲發育的抑制效力。

會議信息

BPCF2023第四屆中國（北京）生物藥工藝高峰論壇四月與您相約北京！

主辦單位：生物藥資訊

會議主題：BPCF2023第四屆中國（北京）生物藥工藝高峰論壇

會議時間：2023年04月03-04號

會議地點：北京朗麗茲西山花園酒店