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        蛋白質組學

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        「青蓮客戶文章」4EBP1在肺癌中感知細胞外葡萄糖缺乏并啟動細胞死亡信號

        2023-02-10 11:15:20

        在癌癥的發展過程中,營養受限的情況很常見。細胞葡萄糖水平和細胞存活的協調是細胞生物學中的一個基本問題,目前尚未完全了解。已知4EBP1是一種翻譯抑制因子,通過控制翻譯起始來調節細胞的增殖和存活。然而,除了翻譯抑制功能外,4EBP1是否還通過其他機制參與腫瘤的生存,尤其是在葡萄糖饑餓條件下仍然未知。20221227日,來自南昌大學的王建斌教授研究團隊在Cell Death & Disease雜志(IF 9.685)上在線發表了題為“4EBP1 senses extracellular glucose deprivation and initiates cell death signaling in lung cancer”的研究論文,該研究利用蛋白質組學技術(青蓮提供技術支持)揭示了4EBP1作為一種新的細胞葡萄糖傳感器在葡萄糖饑餓條件下調節癌細胞死亡的新機制,這與它作為翻譯抑制因子的經典功能不同。


        研究背景

        為了獲得足夠的能量和代謝物來支持細胞的快速生長和增殖,癌細胞會進行代謝重編程。葡萄糖是關鍵營養素之一,癌細胞吸收和代謝葡萄糖的程度遠高于正常細胞。在實體瘤的快速增殖過程中,由于血管生成不足,腫瘤的中心區域總是出現葡萄糖供應不足。葡萄糖饑餓 (GS) 可根據遺傳、表觀遺傳和環境線索觸發不同癌細胞類型的細胞凋亡、壞死、自噬或細胞生長停滯。然而,細胞如何應對這些細胞外變化以及葡萄糖剝奪誘導細胞死亡的分子機制尚未完全確定。

        研究結果

        GS誘導NSCLC細胞中4EBP1的去磷酸化和穩定





        為了探究中心區腫瘤細胞死亡的分子機制,作者分離了來自兩名肺腺癌患者的腫瘤中心區和外周區,并進行了蛋白質組學分析。結果顯示,與腫瘤外周區域相比,腫瘤中心區域有377種蛋白質上調,275種蛋白質下調(圖1A)。對上調蛋白進行KEGG富集分析,發現長壽調節通路在前20個信號通路中富集比高,且變化顯著(圖1B)。有趣的是,在該通路中4EBP1基因差異大。4EBP1在腫瘤周邊區域的蛋白表達幾乎檢測不到,而4EBP1在中心區域顯示出相對高的表達,WB也驗證了該結果(圖1C)。因此,作者懷疑4EBP1可能在腫瘤中心區域的細胞死亡進程中發揮關鍵作用。此外中心區域的葡萄糖水平遠低于外周區域(圖1D),因此作者研究了4EBP1是否可以響應NSCLC中的GS。結果表明GS降低了4EBP1的磷酸化水平并通過抑制其K48連接的泛素化穩定了4EBP1。

        1. GS誘導NSCLC細胞中4EBP1的去磷酸化和穩定


        PTPMT1GS條件下去磷酸化并穩定4EBP1





        為了進一步闡明GS4EBP1的調控機制,作者通過質譜分析找出4EBP1的磷酸酶。免疫共沉淀實驗表明,PTPMT14EBP1間具有相互作用(圖2A),并且在GS下這種相互作用增強(圖2B)。進一步檢查了Phos-Tag凝膠上4EBP1的磷酸化水平。圖2C顯示過表達PTPMT1降低了4EBP1的磷酸化,表明PTPMT14EBP1的磷酸酶。接下來,作者檢測了PTPMT14EBP1表達的影響。過表達PTPMT1上調了4EBP1的表達水平(圖2D),而敲低PTPMT1降低了4EBP1表達水平(圖2E)。接下來檢測了當PTPMT1過表達時,A549細胞核和細胞質中4EBP1的蛋白水平。有趣的是,總的4EBP1和低磷酸化的4EBP1的蛋白水平在細胞質中顯著增加,而在細胞核中僅略有下降(2G)。這些結果表明,PTPMT14EBP1相互作用,然后在細胞核內使4EBP1去磷酸化,導致4EBP1移位到細胞質中。此外還檢測了在GS條件下PTPMT1基因敲除后4EBP1的泛素化和蛋白水平。結果顯示,PTPMT1基因敲除可以恢復4EBP1泛素化水平的降低(2O),并減弱GS誘導的4EBP1蛋白上調(2P)。綜上結果表明,PTPMT1通過阻止4EBP1GS條件下被泛素介導的蛋白酶體降解,使4EBP1去磷酸化并穩定。

        2. PTPMT1GS條件下去磷酸化并穩定4EBP1

        4EBP1GS條件下通過失活STAT3誘導細胞凋亡





        STAT3是一種重要的轉錄因子,可調節一系列抗細胞凋亡基因(bclxl、bcl2、Survivin、MCL-1等)以介導細胞存活。STAT3在Y705位點的磷酸化導致其二聚化、核轉位、DNA結合和轉錄起始。因此,作者評估了p-STAT3-Y705在肺癌中心區和周邊區的表達。研究發現,與腫瘤周邊區域相比,中心區域的p-STAT3蛋白水平較低(圖3A),與4EBP1的蛋白水平完全相反,表明4EBP1可能與STAT3相關。進一步研究了4EBP1被敲低時p-STAT3-Y705在A549細胞中的表達(圖3C),結果表明,在GS條件下,敲低4EBP1使STAT3的磷酸化水平增加。有趣的是,當4EBP1被敲低時,p-STAT3-Y705和STAT3在細胞核中的表達增加,而在GS條件下,STAT3的蛋白水平在細胞質中降低(圖3D)。這些數據表明,在GS條件下,敲低4EBP1可誘導STAT3從細胞質向細胞核的磷酸化和易位,并促進抗凋亡基因的表達。
        圖3. 4EBP1在GS條件下通過STAT3失活誘導細胞凋亡

        4EBP1在體GS條件下抑制腫瘤進展





        為了闡明4EBP1在腫瘤進展中的作用,作者構建了4EBP1基因敲除的A549穩定細胞系(A549-sh4EBP1),并進行了異種移植實驗。MTT測定顯示,由GS誘導的細胞死亡在A549-sh4EBP1細胞中被挽救(圖4B),形態學觀察也得到類似結果(圖4C)。流式細胞儀分析表明,在GS條件下,A549-sh4EBP1細胞的凋亡數明顯低于親本A549細胞(4D)。與親本A549細胞相比,A549-sh4EBP1細胞的移植瘤大小和重量都有所增加(4E,F)。為了證實上述結果,采用免疫組織化學方法檢測了腫瘤中心葡萄糖供應不足區域的細胞凋亡標志物的表達。與親本A549細胞移植瘤中心區相比,A549-sh4EBP1細胞移植瘤中心區p-STAT3-Y705及抗凋亡基因顯著增加,表明了4EBP1基因敲除的異種移植瘤細胞凋亡減少。這些結果進一步表明,4EBP1抑制了GS條件下的腫瘤進展。
        4. 4EBP1抑制體內GS條件下的腫瘤進展

        小結

        該研究首次發現4EBP1在葡萄糖饑餓條件下可以調節癌細胞的死亡。葡萄糖饑餓誘導非小細胞肺癌(NSCLC)細胞總4EBP1蛋白表達上調,并伴隨由高磷酸化狀態向低磷酸化狀態的轉變。PTPMT1(磷酸酶)在此過程中去磷酸化并穩定4EBP1。此外,4EBP1STAT3(信號轉導和轉錄激活因子-3)相互作用,阻止JAKERK磷酸化和激活STAT3,導致抗凋亡基因的表達減少,從而導致細胞凋亡。綜上所述,這些發現闡明了4EBP1在葡萄糖饑餓條件下調節細胞活力的關鍵作用。該研究為腫瘤治療提供了一種新的治療策略,即激活PTPMT1去磷酸化4EBP1,從而導致腫瘤核心區域的細胞凋亡。




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