HBP在轉錄后水平上影響新生脂肪形成

HBP（己糖胺生物合成途徑）是糖酵解的一個分支，負責生成UDP-GlcNAc，UDP-GlcNAc是蛋白O-GlcNAc修飾形成所需的糖基供體。為了研究HBP是否調節新生脂肪形成，研究人員通過在MCF7細胞中敲低HBP途徑中的限速酶谷氨酰胺-果糖6-磷酸轉氨酶1（GFPT1），證明了敲低GFPT1可以降低細胞中UDP-GlcNAc的含量。此外，通過在培養基中添加UDP-GlcNAc發現可恢復新生脂質的合成。這些研究證實了O-GlcNAc修飾可以調控細胞內脂質從頭合成水平以及相關基因mRNA的剪接、穩定性與表達水平。

圖1.HBP在轉錄后水平上影響新生脂肪形成

OGT介導O-GlcNAcylation，核易位和SRPK2激活

有研究表明SRPK2可以促進脂肪生成基因mRNA的穩定性和新生脂肪生成。因此，研究人員檢查了HBP是否通過SRPK2影響新生脂肪形成。通過CRISPR-Cas9技術生成了SRPK2敲除細胞，并比較了有無OGT敲除情況下這些細胞的新生脂肪生成。正如預期的那樣，SRPK2 KO MCF7細胞的新生脂肪形成受到損害，當OGT也被敲除時，這種損傷在這些細胞中也相似。研究表明，SRPK2和OGT在促進脂肪生成的途徑相同，但OGT通過影響SRPK2豐度的其他機制調節SRPK2。并且通過LC-MS / MS分析發現了S490、T492和T498是SRPK2上的主要O-GlcNAcylation位點。

圖2.OGT O-GlcNAcylates SRPK2并促進其核易位和激活

SRPK2 O-GlcNAcylation在核定位信號處誘導其與importin α/β的結合和核易位

在細胞中，importin α/β系統是調控蛋白入核的經典途徑，其中importin α蛋白的N端可以結合importin β蛋白，C端可以結合貨物蛋白的核定位序列（Nuclear-localization signal, NLS），從而形成三元復合物通過核孔將蛋白運入細胞核內。為了確認importin α結合SRPK2的O-GlcNAcylated NLS，研究人員合成了SRPK2 487至523殘基的肽。這些肽包含NLS和O-GlcNAcylation位點S490、T492和T498。通過在體外修飾這些肽以產生O-GlcNAcylated或未修飾的肽。使用表面等離子體共振（SPR）分析，確認了O-GlcNAcylated肽和importin α3之間的直接相互作用，但未修飾的肽與importin α3之間沒有直接的相互作用（圖4G）。這些結果表明O-GlcNAc修飾可以顯著增強SRPK2與importin α蛋白的相互作用，表明importin α可能是O-GlcNAc修飾的“reader”。

圖3.NLS處的SRPK2 O-GlcNAcylation誘導其與importin α/β的結合

OGT-SRPK2途徑與mTOR信號傳導途徑平行

之后，考慮到前人報道的mTORC1/S6K1介導的SRPK2的磷酸化修飾位點與鑒定到的糖基化位點相近，那么其與糖基化修飾之間是否存在相互影響呢？實驗表明，SRPK2糖基化修飾存在與否并不影響SRPK2 S494位點的磷酸化修飾。雷帕霉素是mTOR的抑制劑。在雷帕霉素處理的條件下，SRPK2糖基化修飾仍然能夠響應外界葡萄糖濃度的變化，進一步調控脂質的從頭合成水平。這些結果都提示了OGT介導的SRPK2 O-GlcNAcylation與mTORC1/S6K1通路是平行的。為了評估SRPK2 O-GlcNAcylation的病理作用，基于體內體外實驗證明了SRPK2糖基化修飾可以促進乳腺癌細胞的生長與增殖。

圖4.OGT-SRPK2途徑與mTOR信號傳導途徑平行

O-GlcNAcylation促進貨物蛋白與importin α結合并實現蛋白質的核輸入

研究人員結合自有數據和已發表的數據庫信息，發現來自人類和小鼠的353種蛋白質在NLS里面或附近都存在O-GlcNAcylation位點。這些蛋白質參與多種關鍵的細胞過程，例如基因轉錄、蛋白質修飾和細胞凋亡等。從這些蛋白中，研究人員挑選了RELA與Sp1進行了基于COIP和pulldown的實驗驗證，結果證實了這些蛋白的糖基化修飾可以顯著增強其與相應importin α蛋白的相互作用，進而促進其在細胞核內的定位。