文章用LPS和Nigericin誘導PMA-THP-1細胞建立炎癥細胞模型，用Elisa分析培養基上清中分泌的炎癥因子，結果表明probes-7a和probes-11b表現出較好的抑制IL-1β的作用；用ABPP法測定和識別兩探針的靶向作用，結合SDS-PAGE評估并篩選合成的BBR光親和熒光探針，結果表明probes-11b在一定的濃度范圍內呈現出更顯著的熒光強度。

圖1 篩選和評估BBR探針

文章用probes-11b與PMA-THP-1細胞進行孵育，加入或不加入BBR（100μmol/L）預處理；通過LC-MS/MS分析鑒定被標記的蛋白?；虮倔w（GO）富集表明，44種蛋白密切參與各種炎癥信號通路，其中13種是通過蛋白相互作用分析的炎癥相關蛋白。通過分析這些蛋白的綜合功能和參與途徑，包括EIF2AK2、eEF1A1、PRDX3、DDX3X、VASP和VPS4B在內的六種蛋白可以調節兩種或多種炎癥途徑，并有可能在BBR的抗炎效力中發揮關鍵作用。

圖2 靶蛋白捕獲和功能分析

在HEK-293細胞中進行CETSA實驗，以驗證BBR與四種靶蛋白之間的相互作用。在35至75℃的溫度范圍內，添加BBR（10μmol/L），EIF2AK2、eEF1A1、PRDX3和VPS4B的熱穩定性得到不同程度的增強（圖3A），表明BBR與這四種蛋白質之間可能存在直接相互作用。隨后，使用重組蛋白進行SPR分析以進一步確認，具有EIF2AK2、eEF1A1、PRDX3和VPS4B的BBR的Kd值分別為7.12、13.4、23.7和16.8μmol/L（圖3B–E）。此外，使用Discovery Studio 4.5軟件進行了BBR與四種蛋白質之間的分子對接，對接得分分別為100.2、88.8、86.7和91.6，與親和力值基本一致（圖3F）。這些結果再次驗證了BBR與這四種靶蛋白之間的特異性相互作用，其中BBR與EIF2AK2具有較強的親和力。

圖3 CETSA實驗分析BBR與潛在靶標的親和力

為了進一步了解EIF2AK2的功能作用，選用PMA-THP-1細胞中IL-1β的釋放來驗證NLRP3炎癥小體的功能。BBR抑制NLRP3的表達從而阻斷下游IL-1β的釋放，而EIF2AK2受到其抑制劑C16的藥理學抑制，未觀察到NLRP3表達和IL-1β釋放的減少（圖4D和E），這推斷BBR可能通過作用于EIF2AK1來抑制NLRP2的表達和IL-1β的釋放。

由于EIF2AK2在腦組織中相對高表達，文章驗證了EIF2AK2與人源性小膠質細胞（HMC3）中炎癥通路的相關性。發現BBR可以下調LPS誘導的p-NF-κB p65和pJNK（圖4F和G），而下調EIF2AK2后，BBR對p-NF-κB p65和p-JNK的抑制作用部分或完全消失。這說明，BBR可以通過靶向EIF2AK2影響大腦炎癥反應，并提供了BBR如何在大腦中產生抗炎相關疾病的可能機制，如阿爾茨海默病中的膠質細胞增生和認知障礙。

另外，BBR可以抑制棕櫚酸（PA）誘導的p-JNK水平，并上調HepG2細胞中SIRT1蛋白的表達。結果進一步表明，BBR可能通過與關鍵蛋白EIF2AK2結合來調節炎癥誘導的脂質代謝紊亂(圖4H)。

構建了EIF2AK1敲除小鼠模型，結果發現BBR可能通過靶向EIF2AK2下調IL-1β、IL-6、IL-18和TNF-α分泌（圖5B–F）。肝臟的HE染色結果也同樣發現，在EIF2AK2基因敲除小鼠中，BBR減輕了肝臟組織的炎癥浸潤，而在其他組織中未發現明顯損傷。

圖4 體外功能驗證實驗

圖5 基因EIF2AK1敲除小鼠模型實驗